vellykket dobbelt fordøjelse

1. Hvad er en dobbelt begrænsning fordøjelse?
2. Hvad er enkelt fordøjelse og dobbelt fordøjelse?
3. Hvor lang tid skal en begrænsning fordøje tage?
4. Hvorfor er der to bånd i den fordøjede prøve?
5. Hvorfor fungerer min begrænsningsfordøjelse ikke??
6. Hvordan kan vi forhindre begrænsning fordøjelse?
7. Er DNA-fragmenter positive eller negative?
8. Hvad er dobbelt fordøjelseselektroforese?
9. Hvad betyder det at fordøje DNA?
10. Hvad sker der, hvis du tilføjer for meget restriktionsenzym?
11. Kan jeg gemme en restriktionsfordøjelse?
12. Hvordan beregner du restriktionsfordøjelse?

Hvad er en dobbelt begrænsning fordøjelse?

Dobbelt fordøjelser. Fordøjelse af et DNA-substrat med to restriktionsendonukleaser samtidigt (dobbelt fordøjelse) er en almindelig tidsbesparende procedure. ... Ydelsesdiagrammet for restriktionsenzymer vurderer den procentvise aktivitet for hver restriktionsendonuklease i de fire standard NEBuffere.

Hvad er enkelt fordøjelse og dobbelt fordøjelse?

Enkelt fordøje: kun et restriktionsenzym. Dobbelt fordøjelse: to restriktionsenzymer.

Hvor lang tid skal en begrænsning fordøje tage?

* Pro-tip * Afhængigt af applikationen og mængden af ​​DNA i reaktionen kan inkubationstiden variere fra 45 minutter til natten over. Til diagnostiske fordøjelser er 1-2 timer ofte tilstrækkelige. Til fordøjelser med >1 µg DNA, der bruges til kloning, anbefales det, at du fordøjer i mindst 4 timer.

Hvorfor er der to bånd i den fordøjede prøve?

De to yderligere bånd er sandsynligvis ikke uudskårne plasmidformer (jeg kører uudskåret plasmid-DNA ved siden af) og er mindre end det forventede bånd. Betingelser, komponenter og dets koncentration i den anden reaktion var de samme som i den første.

Hvorfor fungerer min begrænsningsfordøjelse ikke??

Ufuldstændig eller ingen fordøjelse på grund af enzymaktivitet blokeret af DNA-methylering. Hvis dit enzym er aktivt og fordøjer kontrol-DNA'et, og reaktionen er sat op under optimale forhold, men du stadig ser problemer med fordøjelsen, kan det skyldes, at enzymet hæmmes af methylering af skabelon-DNA'et.

Hvordan kan vi forhindre begrænsning fordøjelse?

Hvis der kræves yderligere manipulationer af det fordøjede DNA, er varmeinaktivering (hæve temperaturen til 65 eller 80 ° C i 20 minutter) den enkleste metode til at stoppe en reaktion.

Er DNA-fragmenter positive eller negative?

DNA-fragmenter er negativt ladede, så de bevæger sig mod den positive elektrode. Fordi alle DNA-fragmenter har den samme mængde ladning pr. Masse, bevæger små fragmenter sig hurtigere gennem gelen end store.

Hvad er dobbelt fordøjelseselektroforese?

En dobbelt fordøjelse er en, hvor to restriktionsenzymer bruges til at fordøje DNA i en enkelt reaktion. I dette tilfælde bruger du EcoR I og BamH I. Der er kun et sted i plasmidvektoren for hvert af disse enzymer, og de er placeret på hver side af dit insert-DNA.

Hvad betyder det at fordøje DNA?

Eksperiment 1: Restriktionsfordøjelse

Restriktionsfordøjelse er processen med at skære DNA-molekyler i mindre stykker med specielle enzymer kaldet Restriktionsendonukleaser (undertiden bare kaldet Restriktionsenzymer eller RE'er).

Hvad sker der, hvis du tilføjer for meget restriktionsenzym?

Ufuldstændig fordøjelse kan forekomme, når der bruges for meget eller for lidt enzym. Tilstedeværelsen af ​​forurenende stoffer i DNA-prøven kan hæmme enzymerne, hvilket også resulterer i ufuldstændig fordøjelse.

Kan jeg gemme en restriktionsfordøjelse?

Produktet fra restriktionsfordøjelsen kan let opbevares ved -20 C. Ved 4 C ville det være fint, men for at sikre, at der ikke er nogen aktivitet og ingen stjerneaktivitet, anbefales det at holde det ved -20 C.

Hvordan beregner du restriktionsfordøjelse?

Beregn mængden af ​​hver, du skal tilføje til en begrænsningsfordøjelse for at fordøje 5ug (5000ng) DNA med 5 enheder enzym. For eksempel hvis mit DNA har 190 ng / ul, har jeg brug for: 5000ng / 190ng / ul = 26 ul af min prøve.