begrænsningskortlægning dobbelt fordøjelsesproblem

1. Hvorfor er der dobbelt fordøjelsesbegrænsninger?
2. Hvorfor fungerer min begrænsningsfordøjelse ikke??
3. Hvad sker der, hvis du tilføjer for meget restriktionsenzym?
4. Kan to restriktionsenzymer klippe på det samme sted?
5. Hvordan beregner du restriktionsfordøjelse?
6. Hvor lang tid skal en begrænsning fordøje tage?
7. Er varmeinaktivering af restriktionsenzymer nødvendig?
8. Udløber restriktionsenzymer?
9. Hvordan kan begrænsning fordøjelse forhindres?
10. Hvorfor ville et restriktionsenzym ikke klippe?
11. Hvordan vælger du restriktionsenzymer?
12. Hvorfor skal restriktionsenzymer holdes på is?

Hvorfor er der dobbelt fordøjelsesbegrænsninger?

Fordøjelse af et DNA-substrat med to restriktionsendonukleaser samtidigt (dobbelt fordøjelse) er en almindelig tidsbesparende procedure. Valg af den bedste NEBuffer til at give reaktionsbetingelser, der optimerer enzymaktivitet samt undgår stjerneaktivitet forbundet med nogle enzymer er en vigtig overvejelse.

Hvorfor fungerer min begrænsningsfordøjelse ikke??

Ufuldstændig eller ingen fordøjelse på grund af enzymaktivitet blokeret af DNA-methylering. Hvis dit enzym er aktivt og fordøjer kontrol-DNA'et, og reaktionen er sat op under optimale forhold, men du stadig ser problemer med fordøjelsen, kan det skyldes, at enzymet hæmmes af methylering af skabelon-DNA'et.

Hvad sker der, hvis du tilføjer for meget restriktionsenzym?

Ufuldstændig fordøjelse kan forekomme, når der bruges for meget eller for lidt enzym. Tilstedeværelsen af ​​forurenende stoffer i DNA-prøven kan hæmme enzymerne, hvilket også resulterer i ufuldstændig fordøjelse.

Kan to restriktionsenzymer klippe på det samme sted?

Du kan gøre med korrekte kontroller som fordøjelse med en enkelt begrænsning og begge enzymerne sammen for at sikre, at begge skærer uafhængigt og sammen, og gå videre med dine planer. Desværre var jeg begrænset til disse to enzymer, der tilfældigvis havde steder ved siden af ​​hinanden!

Hvordan beregner du restriktionsfordøjelse?

Beregn mængden af ​​hver, du skal tilføje til en begrænsningsfordøjelse for at fordøje 5ug (5000ng) DNA med 5 enheder enzym. For eksempel hvis mit DNA har 190 ng / ul, har jeg brug for: 5000ng / 190ng / ul = 26 ul af min prøve.

Hvor lang tid skal en begrænsning fordøje tage?

* Pro-tip * Afhængigt af applikationen og mængden af ​​DNA i reaktionen kan inkubationstiden variere fra 45 minutter til natten over. Til diagnostiske fordøjelser er 1-2 timer ofte tilstrækkelige. Til fordøjelser med >1 µg DNA, der bruges til kloning, anbefales det, at du fordøjer i mindst 4 timer.

Er varmeinaktivering af restriktionsenzymer nødvendig?

FAQ: Er det nødvendigt at inaktivere restriktionsenzymer efter vektorfordøjelse? Inaktivering af restriktionsendonukleaser er generelt ikke nødvendig, men i nogle tilfælde kan det øge transformationseffektiviteten.

Udløber restriktionsenzymer?

Alle enzymer analyseres for aktivitet hver 3-6 måneder; udløbsdatoen er angivet på etiketten, der er fastgjort til hvert hætteglas med enzym. Efter 35 års erfaring med restriktionsenzymer har vi fundet ud af, at de fleste er meget stabile, når de opbevares ved -20 ° C i den anbefalede opbevaringsbuffer.

Hvordan kan begrænsning fordøjelse forhindres?

Restriktionsenzymfordøjelsesprotokol

1. Føj komponenter til et rent rør i den viste rækkefølge: ...
2. Inkuber reaktionen ved fordøjelsestemperatur (normalt 37 ° C) i 1 time.
3. Stop fordøjelsen ved varmeinaktivering (65 ° C i 15 minutter) eller tilsætning af 10 mM slutkoncentration EDTA.
4. Det fordøjede DNA er klar til brug i forskningsapplikationer.

Hvorfor ville et restriktionsenzym ikke klippe?

FAQ: Hvorfor skærer mit restriktionsenzym ikke DNA? ... Hvis kontrol-DNA'et spaltes, og det eksperimentelle DNA modstår spaltning, kan de to DNA'er blandes for at bestemme, om en hæmmer er til stede i den eksperimentelle prøve. Hvis en hæmmer (ofte salt, EDTA eller phenol) er til stede, skæres kontrol-DNA'et ikke efter blanding.

Hvordan vælger du restriktionsenzymer?

Når du vælger begrænsningsenzymer, vil du vælge enzymer, der:

1. Flank din indsats, men skær ikke inden i din indsats.
2. Er på det ønskede sted i dit modtagerplasmid (normalt i Multiple Cloning Site (MCS)), men klip ikke andetsteds på plasmidet.

Hvorfor skal restriktionsenzymer holdes på is?

Skal enzymer virkelig holdes på is hele tiden? ... Enzymer skal opbevares og bruges ved deres optimale temperaturer. Enzymer opbevares generelt i glycerol ved -20 ° C. Dette forhindrer dem i at fryse helt, hvilket forårsager proteindenaturering og resulterer i tab af aktivitet.